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Enfermagem e as novas tecnologias

Estratégia saúde da família –...

Do ponto de vista da parasitologia, existem algumas técnicas largamente utilizadas no exame do sangue e de tecidos com o intuito de detectar a presença de parasitas. Estas técnicas descritas na literatura apresentam valores de sensibilidade e especificidade variáveis no que tange à detecção de formas parasitárias em diferentes tecidos, podendo ser a detecção realizada de maneira direta ou indireta. Descrevemos a seguir alguns dos métodos e soluções utilizados de rotina em laboratórios com o objetivo de detectar parasitas no sangue (como o T. cruzi, T. rangeli, Plasmodium spp., etc…) ou em outros tecidos (como Leishmania spp.).

Exame do sangue

O sangue é examinado para os seguintes parasitas; plasmodium, microfilarias, tripanossoma, e leishmania. A técnica mais comumente usada para exame de sangue é o esfregaço de sangue corado.

• Preparo do esfregaço fino e espesso na mesma lamina

Para a rotina de microscopia de malaria, um esfregaço fino e um espesso são feitos na mesma lamina. Um esfregaço fino como indicação, se bem preparado, é também útil para confirmação de espécies. O esfregaço espesso deve ser usado para exame.

• Métodos Diretos: Exame a fresco ou direto

Para realização desta técnica, uma pequena gota de sangue obtida por punção da polpa digital ou de sangue venoso colhido com anticoagulante é colocada entre lâmina e lamínula e examinada exaustivamente ao microscópio em objetiva de (40 x). Entretanto, face aos pequenos volumes de sangue examinados a cada vez, o método necessita ser repetido várias vezes ao dia ou mesmo em dias consecutivos até que o parasita possa ser detectado.

• Preparações coradas

O esfregaço delgado e a gota espessa devem ser preparados e corados pelo método de Giemsa ou de Leishman. O exame do material corado permite, além da detecção, a diferenciação morfológica entre tripomastigotas sanguíneos de T. cruzi e T. rangeli e a identificação específica de Plasmodium spp. A desvantagem dos esfregaços corados é que estes normalmente requerem parasitemias elevadas para evidenciação do parasita. No entanto, a utilização de diferentes métodos parasitológicos isolados ou combinados, podem levar à detecção rápida e precoce da infecção.

Métodos indiretos

• Hemocultura

A hemocultura é uma técnica mais difícil de ser realizada uma vez que requer condições assépticas para a coleta e o manuseio da amostra de sangue, o que a torna pouco prática nos trabalhos de campo. O T. cruzi é capaz de crescer e de multiplicar-se em diferentes meios de cultura acelulares que contenham hemina ou derivados da hemoglobina.

• Xenodiagnóstico

O xenodiagnóstico é uma técnica perfeitamente aplicável para a pesquisa de campo e/ou isolamento de amostras de T. cruzi de pacientes e/ou animais. Este método introduzido por Brumpt em 1914 é largamente empregado ainda nos dias atuais no diagnóstico da doença de Chagas.  Entretanto, sua utilização em pacientes pode ocasionar com certa freqüência reações alérgicas decorrentes da saliva dos triatomíneos levando à rejeição do exame pelo paciente.

• Inoculação em animais de laboratório

A inoculação de camundongos ou cobaias jovens tem sido utilizada por alguns pesquisadores. Face aos avanços científicos atuais, esta metodologia não é mais empregada para o diagnóstico da infecção chagásica. Entretanto, a inoculação de animais pode ser perfeitamente utilizada para isolamento de amostras de T. cruzi a partir de sangue positivo, tanto de pacientes como de outros reservatórios do parasita.

Outros tecidos

• Amostras de pele

Pequenos pedaços de pele são examinados para ancorcerquíase (cegueira de rio), a infecção filarial de humanos. Os vermes vivem em nódulos, em tecidos subcutâneos. Punções corneoesclerais são mais comumente usadas para retirar tiras de pele com ausência de sangue.

• Biópsia

A obtenção de material de biópsia de pele pode ser realizada com o auxílio de uma lâmina de bisturi ou punch de 4 a 6 mm de diâmetro após a anestesia e assepsia do local. No caso das leishmanioses apresentando múltiplas lesões, recomenda-se fortemente que a obtenção de material seja realizada em lesões mais recentes, uma vez que estas se apresentam mais ricas em parasitas. O fragmento de tecido obtido pode ser subdividido para procedimentos diversos como: histopatologia, preparação de esfregaços por aposição, semeadura em meio de cultura, inoculação em hamster. Vale salientar que amostras visando ao diagnóstico molecular devem ser fixadas em etanol a 70%, pois outras substâncias como, por exemplo, o formol pode inibir a reação de PCR.

• Esfregaço corado

Para realização de esfregaços por aposição (imprint) comprime-se repetida e delicadamente o fragmento de tecido sobre uma lâmina previamente desengordurada, deixando-se o material secar à temperatura ambiente. Para a confecção de esfregaços de boa qualidade, recomenda-se a lavagem do fragmento de tecido em solução salina estéril (NaCl 0,85%) para remoção do excesso de sangue. Após a secagem, os esfregaços são fixados por 3 minutos com metanol e corados pelo Giemsa. A pesquisa do parasita é feita em objetiva de 100 x e em geral requer experiência e paciência do microscopista devido baixa parasitemia observada em infecções por Leishmania spp.

• Histopatologia

O fragmento de tecido pode ser processado através de técnicas histológicas convencionais, podendo o material ser corado pela Hematoxilina-Eosina (HE), Giemsa ou Grocott. O exame do material pode revelar, além das leishmanias, outros patógenos como fungos e bactérias permitindo desta forma o diagnóstico diferencial de outras patologias inflamatórias e/ou neoplasias.

• Cultura

A cultura de Leishmania pode ser realizada a partir do fragmento de tecido retirado na biópsia do bordo da lesão que é semeado em meio LIT (liver infusion tryptose), NNN (ágar-sangue)+ LIT ou Schneider. A coleta do material pode ser feita através de aspiração de material da lesão utilizando-se uma seringa de 5 ml com agulha de 25×8’, onde, após assepsia e anestesia local, a agulha é introduzida no bordo da lesão injetando-se cerca de 1-3 ml de salina estéril e, através de movimentos rotacionais, é possível aspirar o material o qual pode ser semeado em meio de cultura.

• Biópsia de baço e fígado

A biópsia de baço e fígado são procedimentos de elevado risco e só devem ser realizados em condições especiais. Face à maior simplicidade e menor risco ao paciente, o material de medula óssea é coletado através de punção do esterno, tíbia ou da crista ilíaca, sendo esta a preferencial em adultos. Na leishmaniose visceral (LV) o agente etiológico é a L. chagasi, a qual é demonstrada em amostras de tecido obtidas por punção de vísceras (baço, fígado e medula óssea).

• Imunohistoquímica

A imunohistoquímica é a união entre técnica imunoquímica envolvendo anticorpos de espécie pré-definidas com sistema de alta sensibilidade de detecção, o que resulta numa reação, com um produto colorido quando observado ao microscópio (ou, em técnicas imunofluorescentes, com microscópios fluorescentes). O poder desta técnica é a observação simultânea da morfologia do tecido, permitindo a integração da morfologia e das informações imunoterápicas.

Diagnóstico imunológico das parasitoses

• Método Indireto

O diagnóstico imunológico indireto de detecção de anticorpos produzidos pelo hospedeiro são de grande importância. A especificidade da resposta imunológica, por tanto dos anticorpos produzidos, é a característica que confere elevado valor preditivo aos testes imunológicos. Outra característica importante na padronização dos testes imunológicos é a estabilidades dos imunocomplexos formados, já que será a detecção desses imunocomplexos que permitirá identificar a presença de anticorpos na amostra obtida.

• Métodos Utilizando Ligantes

Estes métodos utilizam substancias químicas acopladas (conjugadas) a antígenos ou anticorpos, que passam a ter a característica mensurável da substancia química. De acordo com as características do ligante, os testes são classificados em: fluorescentes, enzimáticos, radioativos e luminescentes.

• Imunofluorescência

É uma técnica que permite a visualização de antigénios nos tecidos ou em suspensões celulares utilizando corantes fluorescentes, que absorvem luz e a emitem num determinado comprimento de onda (c. d. o.). Quando o corante está ligado ou conjugado com um anticorpo, os locais de reacção entre o antigénio e o anticorpo conjugado podem facilmente ser visualizados. Os fluorocromos mais utilizados em técnicas de imunofluorescência são a fluoresceína isocianetada (FITC) e rodamina. Os fluoroforos depois de exicitados por um comprimento de onda específico (espectro de absorção) emitem fluorescência (fotões de luz) a um comprimento de onda superior (espectro de emissão). Por exemplo o FITC tem um c. d. o. máximo de excitação a 495 nm (azul a caminho do verde) e uma emissão de fluorescência máxima a 520 (o chamado verde fluorescente). O uso combinado de filtros que barram a luz para c. d. o. previamente determinados permitem visualizar estas moléculas. Virtualmente, alguns antigénios podem ser detectados pela imunofluorescência. A combinação de sensibilidade, especificidade e simplicidade torna este método muito útil.

• Imunofluorescência Direta

É a técnica utilizada para pesquisa de antígeno em células ou tecidos (imuno-histoquímica), usando-se conjugados compostos de anticorpos (geralmente policlonais) específicos para o antigeno em questão e marcados com fluorocromos.

• Imunofluorescência Indireta

É a opção de escolha para detectar Ac circulantes específicos para os mais variados antígenos infecciosos (bactéria, protozoário, helmintos, vírus em culturas de células). Os antígenos serão fixados em lâminas, o soro contendo Ac é incubado sobre eles e esses Ac são detectados por meio de imunoglobulinas específicas produzidas em animais para a classe Ac marcadas com o fluorocromo. São muito empregados antígenos de Toxoplasma gondii, Trypanossoma cruzi, Leishmania, Plamodium, cortes de Schistosoma mansoni, etc.

• Imunoenzimáticos

Nesses testes, o marcador é uma enzima que na presença de um substrato altera sua cor, de modo a diferenciar o teste positivo do negativo. O nome genérico, ensaio imunoenzimatico, pode significar ensaios sem fase sólida, o que significa que os imunocomplexos marcados deverão ser separados da substancia marcado livre. Quando ha um suporte de fase solida o teste ganha o nome de ELISA, de fácil realização, principalmente para detecção de Ac e de Ag circulantes, bastando ter Ag ou Ac absorvidos ao suporte. Esquemas mais utilizados: indireto, de captura (para pesquisa de anticorpos), sanduíche (para pesquisa de antigeno). O teste imunoenzimatico pode ser aplicado em imunohistoquima, utilizando anticorpos específicos e um substrato cromógeno que precipite sobre a estrutura antigenica detectada pelo anticorpo.

• Western Blotting

É um teste imunoenzimatico em que o antigeno é processado por eletroforese em gel de poliacrilamida, separando os componentes antigenicos por peso molecular. Esses componentes são transferidos para membranas de nitrocelulose e nessas tiras se processa o teste. A técnica é muito utilizada para confirmar teste positivos por outros métodos, pois discrimina quais determinantes antegenicos (específicos e inespecíficos) são reconhecidos pelos anticorpos.

• Radioimunoensaio

É um dos métodos mais sensíveis para a análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo, permitindo medidas rápidas e precisas, mesmo em preparações não purificadas, apresenta limiar de detecção da ordem de nanogramas ou picogramas. Com limitações destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional.

O radioimunoensaio pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra.

• Radioimunoensaio Direto

Uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do antígeno não-marcado. Após um período de incubação, remove-se o antígeno não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

• Radioimunoensaio de competição

Uma quantidade fixa do antígeno é imobilizada em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação, o anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

• Radioimunoensaio de captura

Uma quantidade fixa de anticorpo é imobilizada em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após a incubação, remove-se o antígeno não-ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não-ligado é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

• Quimioiluminescência

É uma alternativa viável e utiliza marcadores como ésteres de acridina ou luminol ligados a anticorpos ou antigenos. As moléculas dos marcadores emitem fótons quando catalizam reações de oxidação. Essa propriedade é utilizada para a execução de testes extremamente sensíveis chegando a detectar fentogramas de substancias. As reações são rápidas e automatizadas.

Técnicas imunológicas utilizadas no diagnóstico das infecções

O diagnóstico de certeza de um processo infeccioso é a demonstração do patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biológicos do hospedeiro. Porém nem sempre isso é possível, quer pela ausência do agente infeccioso, quer pela falta de sensibilidade dos métodos utilizados, ou por falhas técnicas ou pelos longos períodos exigidos para uma resposta do laboratório. Os métodos imunológicos diretos ou indiretos têm sido amplamente utilizados para suprir as deficiências dos métodos parasitológicos ou microbiológicos na pesquisa de antígenos, anticorpos ou imunocomplexos, pela rapidez, simplicidade de execução, possibilidade de automação e baixo custo operacional. O conhecimento da aplicação dos testes sorológicos e a interpretação correta dos resultados obtidos são fundamentais para clínicos, patologistas e laboratoristas orientarem seu trabalho visando o diagnóstico correto, associando sempre os resultados obtidos às investigações clínicas e epidemiológicas.

Na pesquisa de anticorpos, os testes sorológicos têm sido utilizados com sucesso como auxiliares importantes no diagnóstico individual ou em inquéritos soroepidemiológicos, devido às suas múltiplas possibilidades de emprego.

Precipitação

As técnicas de imunoprecipitação, baseadas na quantificação de precipitados formados pela reação antígeno-anticorpo, começaram em 1897, Rudolf Kraus, em Viena, relatou a precipitação que ocorria pela interação de antígenos solúveis e seus anti-soros correspondentes e, em 1905, Bechhold, na Alemanha, apresentou seus experimentos sobre imunoprecipitados em géis.

A quantidade de precipitado formado quando, a uma concentração constante de anticorpo, se vai adicionando antígeno é caracterizada por uma curva parabólica, descrita por Heidelberger e Kendall em 1935. Essa quantidade de precipitado depende de vários fatores físico-químicos e imunológicos, mas principalmente das concentrações relativas do antígeno e do anticorpo. Quando as quantidades de antígeno e de anticorpo são equivalentes, a precipitação é máxima, decrescendo quando há excesso de antígeno ou de anticorpo. Precipitados já formados podem se dissolver quando expostos a um excesso de um dos reagentes, devido à reversibilidade da ligação antígeno-anticorpo. O fenômeno de prozona ocorre quando há um excesso de anticorpo e pode causar um erro de interpretação dos resultados, sendo necessário que se faça uma titulação do anticorpo com quantidades fixas de antígeno, para evitar tais erros.

Imunodifusão

A difusão de uma substância solúvel em um meio fluido é um processo pelo qual a substância é transportada, de uma parte para outra, como resultado do movimento molecular ao acaso. A difusão pode ser efetuada em meio gelificado, que impede a formação de correntes, por diferenças de temperatura. Se os poros do gel são consideravelmente maiores do que o tamanho das partículas, a difusão se realiza em meio fluido. Quando os imunoprecipitados são formados no gel ágar, o tamanho dos agregados fica maior do que o diâmetro dos poros e evita-se a difusão dos complexos de antígeno-anticorpo. As técnicas de imunodifusão detectam a reação antígeno-anticorpo através da formação de um precipitado.

A imunodifusão pode ser simples ou dupla. Na imunodifusão simples, ou o antígeno ou o anticorpo permanecem fixados ao suporte e o outro se difunde, até haver a precipitação do complexo. Na imunodifusão dupla, tanto o antígeno como o anticorpo se movem, um me direção ao outro, até haver a precipitação. Em ambos os casos, a difusão pode ser linear (unidimensional) ou radial (bidimensional).

• Imunodifusão Simples em uma dimensão

O método de Oudin para a análise qualitativa e quantitativa dos sistemas de precipitação baseia-se na difusão simples em uma dimensão. Nesta técnica, o anti-soro é incorporado ao ágar, sendo essa mistura colocada em um tubo até formar uma coluna de 35-45 mm de altura. Após a gelificação, o antígeno é colocado no topo da coluna. Os tubos são selados, para evitar evaporação, e deixados a uma temperatura constante durante o período de observação, que é, em geral, de uma semana. A fim de induzir a difusão do reagente externo no gel, sua concentração deve ser bem maior do que a do reagente contido no gel.

• Imunodifusão Radial Simples

Mancini introduziu uma técnica de difusão simples para a determinação quantitativa de antígenos. Neste método, o ágar é misturado com a diluição apropriada do anticorpo específico para determinado antígeno e a mistura é colocada em placa de Petri ou lâmina de vidro. Em locais apropriados do gel são feitos orifícios em que se colocam volumes preciosos das soluções de antígeno a serem testadas, bem como soluções-padrão com pelo menos três concentrações conhecidas do antígeno. O suporte é incubado em câmara úmida até que ocorra a difusão (48 a 72 horas), sendo então determinada área do halo de precipitação formado. Para uma dada concentração de anticorpo, a área do halo formado, ao término da difusão é diretamente proporcional à concentração do antígeno. A sensibilidade do teste pode variar com a concentração do anti-soro. Uma concentração baixa de anti-soro aumenta a sensibilidade, mas não permite a medida de concentrações de antígeno em excesso. Por outro lado, uma alta concentração de anti-soro diminui a sensibilidade, mas permite a quantificação de concentrações maiores de antígeno.

Pelo método de Fahey, os halos de precipitação podem ser medidos antes do término da difusão e, neste caso, o logaritmo da concentração do antígeno é proporcional ao diâmetro do halo. Empregando-se antígenos-padrão diluídos em série é possível construir curvas-padrão, e as equações que descrevem tais curvas podem ser utilizadas para a determinação da concentração de antígeno correspondente a qualquer diâmetro. A sensibilidade destes métodos varia de 1 a 3 µg/ml de antígeno. Uma importante aplicação desta técnica é a quantificação das concentrações de imunoglobulinas séricas.

• Dupla Imunodifusão de Ouchterlony

O método baseia-se na precipitação que ocorre na região de equivalência quando o antígeno e o anticorpo se difundem no ágar. O complexo antígeno-anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arco de precipitação. A velocidade de difusão de cada substância é regida pelas leis da difusão e depende da concentração e do tamanho da molécula, do tamanho dos poros do gel, da temperatura, da concentração do ágar e de sua pureza.

O teste é realizado colocando-se uma camada de ágar em lâminas de vidro ou placas de Petri previamente recobertas com uma fina camada de ágar. Após a gelificação, são feitos orifícios no ágar, de acordo com o sistema a ser analisado. As soluções contendo o antígeno e o anticorpo são colocadas nos orifícios do ágar, as placas ou lâminas são incubadas em câmara úmida com vedação a uma temperatura conveniente e constante por 18 a 24 horas.

Cada linha em um espectro de precipitação corresponde a um par de antígeno-anticorpo. A ausência do antígeno ou do anticorpo é indicada pela ausência da linha. Cada precipitado funciona como uma barreira para os reagentes que o formam e impede sua difusão além do sítio da precipitação. Essa barreira é imunoespecífica e a difusão de outros reagentes não é impedida, a menos que a densidade dos agregados provoque um obstáculo mecânico.

O método de Ouchterlony permite a comparação de vários sistemas antigênicos, desde que colocamos em orifícios adjacentes contra um mesmo sistema de anticorpos, formando vários padrões que indicam a existência, ou não, de determinantes antigênicos comuns. As linhas formadas podem ser completamente coalescentes, no caso de antígenos com os mesmos determinantes (identidade imunológica); podem apresentar um “esporão”, como no caso de antígenos parcialmente relacionados (identidade parcial); ou podem formar uma interseção, indicando a ausência de relação entre os antígenos (não-identidade). Quando os reagentes estão em quantidades balanceadas, a linha de precipitação formada terá a curvatura voltada para o orifício que contém a substância de maior peso molecular, que se difunde mais lentamente.

O método pode ser utilizado para avaliações semiquantitativas quando se conhece a especificidade das linhas de precipitação, como, por exemplo, na titulação de antígenos ou de anticorpos. Podem-se caracterizar antígenos de vários agentes infecciosos empregando-se anticorpos de especificidade e reatividade conhecidas. A formação de uma única linha de precipitação dá indícios da pureza do antígeno ou do anticorpo, porém de um modo muito preciso.

O método apresenta várias limitações pois requer 18 a 24 horas de difusão para que a reação se processe, não sendo útil em casos em que se necessita de um método rápido de diagnóstico. Ao mesmo tempo, apresenta uma sensibilidade baixa e limita-se à detecção de reações antígeno-anticorpo em que há formação de precipitados.

• Eletroimunodifusão

Nas técnicas de imunodifusão, o antígeno e o anticorpo entram em contato e precipitam no ágar por um processo de difusão. Porém, a velocidade de precipitação pode ser muito aumentada se a migração for dirigida por um campo elétrico, como no caso da eletroimunodifusão. Está técnica tem sido empregada na detecção de antígeno.

• Eletroimunodifusão Dupla Unidimensional

O princípio básico do método é a eletroforese do antígeno e do anticorpo simultaneamente, que migram em direções opostas a partir dos orifícios separados do gel, resultando na precipitação em um ponto intermediário entre as suas origens.

Este método requer que o antígeno e o anticorpo em teste apresentem diferentes mobilidades eletroforéticas. O pH do tampão deve ser escolhido a fim de otimizar os efeitos eletroendosmóticos do anticorpo para o catodo (pólo negativo), enquanto o antígeno se move em direção do anodo (pólo positivo).

• Eletroimunodifusão Simples Unidimensional

Nesta técnica, o anti-soro específico para o antígeno ou antígenos que se quer quantificar é incorporado ao gel, que é colocado em lâmina de vidro numa posição fixa de modo que o anticorpo não migre. O material contendo o antígeno é colocado em um pequeno orifício e é submetido a uma eletroforese. O padrão de imunoprecipitação resultante se assemelha a um foguete. Esse padrão ocorre porque a precipitação se forma nas margens laterais dos limites do antígeno vai precipitando, sua concentração diminui, e as margens laterais convergem para uma ponta. A distância total de migração do antígeno para uma dada concentração de anti-soro é linearmente proporcional à concentração do antígeno.

Aglutinação

A reação de aglutinação caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície.

A aglutinação pode ocorrer tanto com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários, etc.) como com partículas inertes (partículas de látex, poliestireno, bentonita, etc.), ou mesmo com células antigenicamente não relacionadas (hemácias, bactérias) às quais se adsorvem ou se fixam antígenos solúveis. No primeiro caso, a reação é dita aglutinação direta, e no segundo, aglutinação indireta ou passiva.

As reações de aglutinação são muito empregado para o diagnóstico laboratorial de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoárias e fungos, doenças auto-imunes, na detecção de hormônios, na tipagem de grupos sanguíneos dos sistemas ABO e Rh, etc.

Os testes de aglutinação podem ser realizados em tubos ou placas. Se o soro possuir um elevado título de anticorpos aglutinantes, pode-se observar o fenômeno de prozona, obtendo-se falsos resultados negativos. Esse efeito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro.

• Teste de Aglutinação Direta

Na reação de aglutinação direta utilizam-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada. Hemácias, bactérias, fungos, protozoários podem ser aglutinados diretamente por anticorpo. Os testes para detectar anticorpos específicos são realizados empregando-se diluições em série do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antígeno. Após um período de incubação, a aglutinação se completa e o resultado é geralmente expresso  como o título do anti-soro, isto é, a máxima diluição em que ocorre a aglutinação.

• Teste de Inibição de Hemaglutinação Direta

A inibição da hemaglutinação direta é baseada na capacidade que certos antígenos virais têm de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemácias. Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as partículas virais, resultando na inibição da aglutinação, indicando um teste positivo para a presença de anticorpos. Estes testes não distinguem entre IgG e IgM. Este método é usado para detectar anticorpos contra o vírus da rubéola, sarampo, influenza e certos enterovírus.

• Teste de Aglutinação Passiva ou indireta

Para o teste de aglutinação passiva, as hemácias e as partículas inertes (látex, bentonita, “sepharose”, leveduras, etc.) podem ser sensibilizadas por adsorção passiva, devida ao contato direto com os antígenos solúveis, por adsorção via agentes químicos, como ácido tânico, cloreto de cromo e por conjugação do antígeno, por meio de ligações químicas covalentes, fornecendo reagentes estáveis. Devido à grande diversidade de antígenos que podem se ligar às células ou partículas, a aplicação dos testes de aglutinação passiva é muito variada.

• Teste de Hemaglutinação Passiva

A verificação de Boyden, em 1951, de que proteínas podiam ser adsorvidas a hemácias tratadas com ácido tânico e que essas células podiam ser aglutinadas por anticorpos específicos possibilitou o emprego dos métodos de aglutinação para a detecção de anticorpos contra várias substâncias.

Hemácias estão entre os melhores suportes de antígenos para os testes de aglutinação, pois há uma série de antígenos que pode ser ligada à sua superfície para fornecer um sistema indicador sensível na detecção de anticorpos. Além disso, os testes em placa permitem que a determinação do ponto final da reação seja feita diretamente. Hemácias possuem uma superfície complexa, o que facilita a ligação de muitos antígenos e, freqüentemente, acarreta a presença de anticorpos heterófilos no soro de muitos animais. Tais anticorpos devem ser removidos antes da execução do teste.

Antígenos polissacarídeos prontamente aderem a hemácias, enquanto antígenos protéicos requerem pré-tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo.

O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e é considerado positivo quando se verifica a formação de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em “V”, e negativo quando as hemácias sedimentam formando um “botão” compacto. O título da amostra testada será a máxima diluição em que ainda se observa a formação do tapete.

O teste detecta anticorpos das classes IgG e IgM e, embora os anticorpos IgM sejam 750 vezes mais eficientes na aglutinação que os IgG, a quantidade de antígeno necessária para se obter a máxima reatividade com IgM é muito maior do que a necessária para a máxima reatividade com IgG. Empregando-se hemácias sensibilizadas com antígenos protéicos, quando adequadamente padronizado, o teste detecta anticorpos em níveis de concentração de 0,01 µg/ml. Há vários sistemas comerciais para a pesquisa de anticorpos que utilizam esta técnica, entre eles, os sistemas de Trypanossoma cruzi, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, etc.

• Teste de Inibição de Hemaglutinação Passiva

O teste de inibição de hemaglutinação passiva é sensível e específico na detecção de pequenas quantidades de antígenos solúveis, haptenos ou anticorpos que competem com a substância homóloga com que a hemácia foi sensibilizada.

O princípio do teste baseia-se na competição, pelos sítios de combinação do anticorpo, entre o antígeno fixado à hemácia e o antígeno solúvel ou o hapteno. O grau de inibição relaciona-se com a quantidade do antígeno presente na amostra e, também com a afinidade pelos sítios de combinação do anticorpo.

Este método requer pequenas quantidades de reagentes, detecta antígeno na ordem de 0,1 a 10 µg/ml, apresenta especificidade elevada e pode ser empregado em sistemas em que antígenos solúveis ainda não foram obtidos. Tem sido empregado na detecção de antígeno na hepatite e na hemofilia.

• Teste de Aglutinação do Látex

Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsorção de proteína solúvel e antígenos polissacarídicos, funcionando como sistema indicador da reação antígeno-anticorpo.

O teste pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos. A aplicação mais comum é na detecção do fator reumatóide, que é anticorpo da classe IgM pentamérico dirigido contra IgG. Adsorvendo IgG passivamente ás partículas do látex, haverá a exposição dos determinantes de IgG que reagem com o fator reumatóide, resultando em aglutinação. Este método é mais sensível e menos específico que a hemaglutinação passiva para a detecção de fator reumatóide. O fator reumatóide deve ser um auto-anticorpo à porção Fc de IgG agregada ou alterada, ocorrendo doenças auto-imunes, em processo agudos ou crônicos, em doenças reumáticas, em doenças infecciosas, degenerativas, etc..Também é empregada na pesquisa da proteína C que aparece no soro de pacientes na fase aguda de várias infecções, como estafilocócica ou estreptocócica, febre reumática, etc.

Ensaios líticos

• Teste de Fixação do Complemento

A ligação antígeno-anticorpo promove a fiação do complemento, cujo consumo, in vitro, pode ser empregado para detectar a presença de anticorpos, antígenos ou ambos.

O teste utiliza um sistema homogêneo (não é preciso a separação entre fases) e é realizado em duas etapas. Na primeira etapa, o antígeno é incubado, na fase fluida, na presença de uma quantidade definida de complemento. Se o antígeno e o anticorpo correspondentes estiverem presentes, a cascata do complemento será ativada pela via clássica e haverá consumo de complemento. Na segunda etapa, adiciona-se o sistema indicador da reação que consiste em hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo anti-hemácias de carneiro obtido em coelhos). A medida da atividade hemolítica do complemento no sistema indicador permite determinar a presença ou não de antígeno ou anticorpo na mistura inicial e sua quantidade. A atividade hemolítica remanescente pode ser quantificada empregando-se diluições seriadas da amostra a ser analisada. Tanto o anticorpo como o antígeno devem ser destituídos de ação anticomplementar, ou seja, não podem ativar o complemento separadamente. O complemento deve ser obtido de soro de cobaia e colhido e estocado de maneira apropriada para preservação da atividade hemolítica. Anticorpos humanos IgM, IgG1, IgG2 e IgG3 fixam complemento pela via direta, enquanto o IgA fixa complemento pela via alternativa.

O teste pode ser qualitativo ou quantitativo. O método qualitativo baseia-se na titulação do complemento residual que não foi consumido pela reação antígeno-anticorpo com o sistema indicador. Esse método, embora sensível, é muito laborioso para fins diagnósticos. O método quantitativo possui muitas variações técnicas, entre as quais o micrométodo, que permite revelar quantidades mínimas de complemento fixado.

Atualmente, embora haja testes bem mais sensíveis, ainda é utilizado na sorologia da doença de Chagas, da sífilis e de vários vírus, rickettsias e fungos. Apresenta a vantagem de poder ser empregado para diferentes sistemas sem mudar os parâmetros do teste, porém é complexo e trabalhoso.

Teste de imunofluorescência

O teste de imunofluorescência é um dos mais utilizados no diagnósticos de laboratório para a pesquisa de anticorpos e cada vez mais com anticorpos monoclonais para a pesquisa de microrganismos e seus componentes em espécimes clínicas. Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.

• Teste de Imunofluorescência Direta

O teste de imunofluorescência direta é empregado na pesquisa e na localização de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com fluorocromo (conjugado). O conjugado se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável. O anticorpo não ligado é removido por lavagens e o preparado é observado em microscópio de fluorescência.

O teste tem sido utilizado para a pesquisa de Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionnella sp, Escherichia coli, estreptococos ß-hemolítico do grupo A e vários vírus, com os do herpes simples tipo 1 e 2, o citomegalovírus, os da influenza tipo A e B, os da parainfluenza 1,2 e 3, o da varicela-zoster e o adenovírus.

• Teste de Imunofluorescência Indireta

A sensibilidade dos testes de imunofluorescência é limitada ao nível de fluorescência detectável pelo olho humano; por isso, o teste de imunofluorescência indireta tem sido empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade. Pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos.

• Para a Pesquisa de Antígenos

Consiste na incubação da célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal conhecido ou monoclonal, levando a formação de um imunocomplexo. Após a lavagem, a preparação é incubada com um conjugado de antiimunoglobulina produzida em outra espécie de animal.

• Para a Pesquisa de Anticorpos

Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. Após lavagens, a preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno.

Técnicas com marcadores radioativos

• Radioimunoensaio

O radioimunoensaio é um dos métodos mais sensíveis para a análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo, permitindo medidas rápidas e precisas; mesmo em preparações não purificadas, apresenta limiar de detecção da ordem de nanogramas ou picogramas. Com limitações destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional.

O radioimunoensaio pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra.

• Radioimunoensaio Direto

No radioimunoensaio direto, uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do antígeno não-marcado. Após um período de incubação, remove-se o antígeno não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.

A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

• Radioimunoensaio de competição

No radioimunoensaio de competição, uma quantidade fixa do antígeno é imobilizada em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação, o anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel são removidos por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.

A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

• Radioimunoensaio de captura

No radioimunoensaio de captura, uma quantidade fixa de anticorpo é imobilizada em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após a incubação, remove-se o antígeno não-ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não-ligado é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.

A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

Técnicas imunoenzimáticas

As técnicas imunoenzimáticas são baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a detecção, titulação e quantificação de substancias de interesse biológico.

• Imunoperoxidase

As técnicas para localização de constituintes celulares seguem o mesmo princípio da imunofluorescência, com a diferença de que, em vez do fluorocromo, emprega-se a enzima, que tem maior capacidade de amplificação. A enzima converte o componente cromógeno (substrato+doador de hidrogênios) em produto insolúvel que precipita no sítio da reação. Esses precipitados podem ser visíveis ao microscópio eletrônico.

• Enzimaimunoensaio

O enzimaimunoensaio é um método quantitativo em que a reação antígeno-anticorpo é monitorada por medida da atividade enzimática. Desempenha um papel muito importante no laboratório clínico, pois, além da elevada sensibilidade comparável à do radioimunoensaio, apresenta vantagens de utilizar reagentes estáveis, estar livre das exigências de trabalhar com radioisótopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como à automação sofisticada.

Uma característica comum entre radioimunoensaio e enzimaimunoensaio é que ambos medem, diretamente, a interação entre o antígeno e o anticorpo, não dependendo de um segundo fenômeno como precipitação, aglutinação ou fixação de complemento.

O enzimaimunoensaio foi classificado em dois tipos: homogêneo e heterogêneo. Nos ensaios homogêneos não é necessária a separação entre os complexos antígeno-anticorpo e o antígeno e/ou o anticorpo livres, pois a interação antígeno-anticorpo modula a atividade da enzima. Nos ensaios heterogêneos, a separação é necessária, pois a atividade da enzima não é alterada pela reação antígeno-anticorpo. Os ensaios homogêneos são mais utilizados para a detecção de haptenos e os heterogêneos para a detecção de moléculas maiores.

• ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

Esse teste foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio para a detecção de antígenos e anticorpos. O seu princípio básico é a imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do anticorpo.

O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. Especial atenção deve ser dada a fase sólida, cujas propriedades podem variar de acordo com a composição. O grau de pureza do antígeno ou do anticorpo da fase sólida é muito importante, pois qualquer material heterólogo competirá pelo espaço na placa.

O objetivo do ensaio é a quantificação ou verificação da presença de um antígeno ou anticorpo.

• SLFIA (Substrate-Labelled Fluorescent Immunoassay)

Pode ser utilizado para detectar reagentes de alto e baixo peso molecular. Foi desenvolvido pela Ames Company of Miles Laboratories. No ensaio, um substrato fluorogênico da ß-galactosidase é ligado covalentemente a um antígeno protéico ou hapteno. Se o anticorpo específico reage com antígeno, a enzima ß-galactosidase não cliva o substrato, por impedimento estérico. Se a amostra tiver antígeno, este se ligará ao anticorpo e o substrato ligado ao antígeno ficará livre e reagirá com a enzima para formar o produto fluorescente. O grau de fluorescência é proporcional à quantidade de antígeno na amostra.

Métodos moleculares

• Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

O desenvolvimento da PCR foi possível graças à descoberta de uma enzima termoestável com atividade de polimerase (Taq DNA polimerase) isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus, a qual promove a síntese de DNA in vitro no sentido à semelhança do que ocorre in vivo.

A PCR apresenta-se como um método de extrema sensibilidade, permitindo a geração exponencial de cópias de seqüências específicas a partir de um DNA molde, por meio de uma síntese enzimática in vitro. Resumidamente, pela alternância de ciclos de temperatura da reação promove-se a desnaturação da fita molde, ligação dos iniciadores e extensão das novas cadeias de DNA pela ação da Taq DNA polimerase, resultando em cópias exatas do segmento-alvo. Dada a sua grande capacidade de síntese, a PCR é capaz de amplificar até 4 X 106 vezes uma dada seqüência de DNA molde de dupla fita em 25 ciclos de reação. A PCR apresenta uma taxa calculada de erro de incorporação de cerca de 2 X 10 -4.

Após sua rápida difusão no meio científico, a PCR tem sido amplamente utilizada na detecção e caracterização de agentes etiológicos de importantes parasitoses humanas, como, por exemplo, T. cruzi, Leishmania spp.,  Plasmodium spp., Wuchereria bancrofti, Onchocerca volvulus, Giárdia lamblia, Entamoeba histolytica, Taenia spp., Toxoplasma gondii, Schistosoma mansoni e Fasciola hepatica.

Basicamente a PCR utiliza cinco componentes para cada reação de amplificação, que seguem: o DNA molde, deoxinucleotídeos trifosfatados, uma solução tampão contendo KCL, MgCl2 e Tris-HCl em pH e concentrações distintas, a enzima Taq DNA polimerase e os iniciadores. A qualidade e a concentração de cada componente da reação têm influência direta no funcionamento da reação, na qualidade dos resultados, assim como na sensibilidade e especificidade da mesma.

• Extração de DNA

Ao extrair-se DNA total de determinado tecido com o intuito de pesquisar a presença de DNA de um agente etiológico em particular, independente do método de extração e do tecido, deve-se considerar o excesso de DNA do hospedeiro, o que pode, por vezes, levar a uma inibição da reação de amplificação. Dentre os possíveis inibidores, podemos citar, por exemplo, a presença excessiva de proteínas e, em particular, a hemoglobina. Da mesma forma, reagentes utilizados nos processos extrativos podem levar a uma inibição da reação, como, por exemplo, resíduos de formol e fenol. Usualmente biópsias de tecidos são acondicionadas em solução de formol a 10% para a prática histológica. Para os diagnósticos moleculares, parte da amostra coletada deve ser preservada em etanol a 70%, o qual sabidamente não tem influência na reação de amplificação.

• Com Relação à Dosagem de DNA

A pureza e a quantidade de DNA a ser utilizada em uma reação de amplificação também devem ser consideradas. A dosagem de DNA, assim como a presença de certos contaminantes, pode ser facilmente realizada por espectrofotometria. Na ausência deste equipamento, a dosagem de DNA extraído pode ser realizada de maneira mais fácil e menos custosa por meio de eletroforese em géis de agarose, comparando-se com padrões conhecidos. Entretanto, esse método não revela a presença de contaminantes. A dosagem de DNA faz-se necessária, pois quantidades muito elevadas de DNA também podem levar a uma inibição da reação de amplificação.

• Iniciadores

Os iniciadores são pequenos oligonucleotídeos com tamanho variando entre 10 e 30 bases, que possuem seqüência homóloga às porções terminais de segmentos de DNA-alvo que se deseja amplificar. Para tanto, o desenho de um par de iniciadores necessários à amplificação específica de DNA de dupla fita é usualmente realizado a partir de uma seqüência conhecida, devendo cada um dos iniciadores se complementar a cada uma das fitas do DNA molde. O tamanho e o conteúdo de bases de um iniciador estão diretamente relacionados à temperatura de ligação deste à fita molde e, por conseqüência, à especificidade da reação. DNA de dupla fita apresenta ligações entre bases que podem ser realizadas por duas (A=T) ou três(G=C) pontes de hidrogênio. Assim, quanto maior o conteúdo de G=C em uma cadeia de DNA, maior será a energia necessária à sua desnaturação, ou seja, maior será a temperatura necessária à separação das duas fitas da cadeia. Essa temperatura necessária para romper a ligação intramolecular chama-se temperatura de desnaturação. A subseqüente ligação entre um iniciador e a fita molde homóloga é dependente do conteúdo de bases G/C desta seqüência, o que determina a temperatura de ligação (Tm ou melting temperature). Assim, a temperatura de ligação está diretamente relacionada à especificidade da reação, também chamada estringência.

• Deoxinucleotídeos Trifosfatados

Os laboratórios de pesquisa e clínicos utilizam atualmente deoxinucleotídeos trifosfatados. Cabe salientar que em cada reação devem ser utilizadas concentrações iguais de cada um dos nucleotídeos com o intuito de minimizar a possibilidade de incorporações errôneas. A cada ciclo da reação de amplificação, a hidroxila(OH), presente na extremidade 3’ da nova fita de DNA que está sendo sintetizada, cliva dois fosfatos do dNTP que está sendo incorporado pela Taq DNA polimerase na nova cadeia de DNA. Assim, a cada nucleotídeo monofosfatado incorporado é liberado um pirofosfato.

• Tampão

Dentre os distintos componentes da PCR, a composição e o pH do tampão podem influir de maneira significativa na sensibilidade da reação. Os tampões utilizados na PCR são geralmente compostos por três reagentes principais: o cloreto de magnésio(MgCl2), o cloreto de potássio(KCl) e o TrisHCl. Alguns protocolos ainda utilizam outro reagentes, como albumina bovina (BSA), gelatina, detergentes não-iônicos ou dimetilsulfóxido(DMSO), com o objetivo de propiciar melhor estabilidade à Taq DNA polimerase, ainda que suas eficácias sejam discutidas. Uma vez preparados os tampões, deve-se realizar uma reação utilizando-se em cada tubo de reação um tampão diferente, porém todos os demais componentes da reação, incluindo-se o DNA molde, permanecem os mesmos.

• Taq DNA Polimerase

A Taq apresenta uma capacidade de incorporação de cerca de 35 a 100nt/s, o que equivale a uma velocidade de 2kb/min. Desta forma, observa-se que a chamada temperatura de extensão é usualmente a mesma em diferentes protocolos (72ºC), apesar da enzima apresentar um amplo espectro de atividade em relação à temperatura. Seu transporte e estocagem devem ser realizados em temperatura abaixo de zero, especialmente em gelo seco, e sua manutenção feita em freezer a -20ºC OU -70ºC.

• Visualização dos resultados

A visualização do resultado de uma PCR é realizada através da eletroforese dos produtos de amplificação em géis de poliacrilamida ou agarose. Este procedimento permite a separação de produtos de amplificação pelo seu tamanho(em pares ou kilobases) utilizando-se um campo elétrico. A determinação do tamanho dos produtos de amplificação é realizada através de comparação com padrões de tamanho molecular conhecidos. Estes padrões são usualmente o DNA total de bacteriófagos ou plasmídeos digeridos com enzimas de restrição. Na eletroforese em gel de agarose os produtos são corados pelo brometo de etídio e a revelação é feita por exposição à luz ultravioleta.

• Aplicações Práticas

A utilização da PCR no intuito de detectar a infecção de reservatórios vetores, assim como a infecção humana por diferentes parasitos. O primeiro registro do uso da PCR na detecção do T. cruzi em fezes de triatomíneos foi descrito em 1989. Foi utilizada como alvo uma seqüência de 195 picogramas do DNA nuclear do protozoário, não apresentando reatividade cruzada com o DNA humano, de camundongo, de Leishmania spp. e de tripanossomas africanos. Entretanto, a reação também foi negativa quando utilizada na pesquisa de DNA do T. cruz no sangue de pacientes chagásicos crônicos.

Outros autores igualmente detectaram o DNA de T. cruzi em amostra de fezes secas de triatomíneos experimentalmente infectados, obtendo maior taxa de positividade via PCR do que através de exame direto ao microscópio. Iniciadores para a amplificação específica do gene do miniéxon permitiram diferenciar o T. cruzi do T. rangeli pelo tamanho dos produtos de amplificação de cerca de 582pb e 858pb, respectivamente. Utilizando um outro par de iniciadores dirigidos à região conservada deste mesmo gene observaram-se produtos de amplificação de tamanhos distintos para as 10 diferentes espécies do gênero Leishmania, assim como para quatro espécies do gênero Trypanosoma testadas. Outros iniciadores T. rangeli específicos desenvolvidos permitiram diferenciar o parasito T. cruzi de maneira inequívoca em triatomíneos; entretanto, a presença de excesso de DNA do hospedeiro inibe a reação de PCR.

• Gene de interesse

Genes multicópias que não apresentam homologia com o DNA do hospedeiro são seqüências-alvo de grande interesse para fins de diagnóstico ou caracterização de parasitos. Dentre essas, poderíamos citar os minicírculos de kDNA e gene do miniéxon para os tripanossomatídeos, DNA de microssatélites e RNA mensageiros (mRNA).

• Técnicas de Rotina em histologia

A observação de células e tecidos ao microscópio trás fundamentos onde exigem que o material seja processado antes de ser examinado:

  • O material deve ser preservado para que o aspecto morfológico seja o mais semelhante possível ao material em vivo.
  • O material deve permitir a passagem da luz através dos seus constituintes e, portanto, deve ser fino e transparente para ser observado no microscópio.
  • Como os componentes celulares e teciduais na sua grande maioria são incolores, é necessário tingi-los diferencialmente para que se forme uma imagem visível e compreensível ao observador,
  • A preparação resultante da lamina histológica deve de preferência ser permanente permitindo seu estoque por longo tempo e sua observação ao microscópio quantas vezes forem necessárias sem que haja perda de suas características

• Métodos de rotina em histologia

Protocolo geral de preparo de lâminas Histológicas

Fixação -> Processamento -> Corte -> Coloração (Histoquímica e Imunohistoquímica) -> Montagem.

Fixação

É o primeiro passo para o processamento do material biológico, pretende-se manter o material morfologicamente o mais, semelhante possível que quando estava vivo, esse processo é feito através de soluções químicas dos componentes extracelulares e intracelulares sem que haja deformação do material. Essas mudanças químicas tornam o material muito mais estável, evitando a degradação do mesmo.

• Tipos de Fixação

Imersão: a peça é mergulhada dentro do fixador imediatamente após ser retirada do organismo, a peça não deve ter mais de 1 cm de espessura máxima, porém, recomenda-se 0,5 cm. Se for um órgão encapsulado por tecido conjuntivo, a retirada desta cápsula ou secção do órgão em duas ou mais partes facilitará a penetração do fixa dor e a qualidade da preservação dos seus componentes. como o material biológico é sempre rico em água, deve-se tomar cuidado para que o fixador seja, no mínimo, 2/3 do volume total compreendido pelo volume da peça mais o volume de fixador  no fracos onde será feita a fixação.

Perfusão: é aquela que o fixador chegará aos tecidos através do sistema circulatório do organismo é maneira mais eficaz de fixação, mas também a mais complicada. Esse tipo de fixação é muito útil para preservar os tecidos delicados, como o nervoso, e para fixar ao mesmo tempo todos os órgãos do organismo. É um método muito eficiente, pois vale-se da irrigação dos capilares sanguíneos fazem de todos os tecidos, colocando o fixador em contato com praticamente todas as regiões mais profundas dos órgãos.

• Fixadores

Existem muitos tipos de soluções de e agentes fixadores em histologia, cada um com suas peculiaridades e com suas especialidades. O fixador mais utilizado na rotina histológica é a formalina ou o formaldeído. O formaldeído pode ser usado ser usado como uma solução aquosa simples ou tamponada, ou em conjunto com outras substâncias.

Além das soluções de formaldeído, outros fixadores, podem ser adotados em técnicas específicas ou então serem utilizados conforme as preferências individuais. Uma dessas soluções é o fixador de Bouin, que tem uma rápida penetração, provoca pouca retração dos tecidos.

Soluções fixadoras de rotina: Solução de formaldeído a 10%, Solução tamponada de formaldeído a 10 %, Solução salina de formaldeído a 10%, Fixador de Bouin.

Processamento de tecidos

Para a obtenção de fatias finas e translúcidas o suficiente para que possam transmitir a passagem da luz e que conseqüentemente, possam ser observadas ao microscópio, como os tecidos geralmente são moles fica muito difícil obter cortes com espessuras entre 4 e 5 Mm, que permitam a observação das células dos tecidos sem que haja sobreposição de camadas. Com objetivo de tornar o material mais duro par ao corte sem que ocorram alterações na sua constituição, existem duas maneiras de processá-lo: por congelação ou por inclusão em meio sólido. Após o processamento o material será cortado em fatias muito finas em um aparelho chamado micrótomo e então distendido e colocado em uma lâmina de vidro para posteriormente ser corado.

Congelação: Esta técnica de processamento de tecidos é utilizada basicamente por dois motivos: rapidez no processamento e preservação de características bioquímicas dos tecidos. O material torna-se duro para o corte porque é submetido a baixas temperaturas e pode ser cotado imediatamente, porém, se o processo não for realizado com muito cuidado a formação dos cristais de gelo tanto no meio intra quanto no extracelular, pode deformar os tecidos.

Inclusão em meio sólido: Inclusão do material dentro de um meio mais rígido. Quando se diz incluir o material, significa fazer com que o meio de inclusão penetre nos tecidos em substituição de outro componente das células e do meio extra celular. Assim o meio de inclusão substituirá a água dos tecidos, o que exigirá que durante o processamento haja desidratação completa do material. Ao termino do processamento, o material fará parte de um bloco único e continuo com o meio de inclusão que será cortado no micrótomo fornecendo uma fatia que conterá o material. Após o corte ser colado na lâmina, o meio de inclusão é retirado e o material é novamente hidratado para que se procedam as técnicas de coloração ou de Imunohistoquímica. Os meios de inclusão mais utilizados são a parafina e as resinas, sendo o mais utilizado a parafina.

Cortes: Os cortes são feitos num aparelho chamado micrótomo. Este aparelho é munido de navalha de aço com um fio muito fino e regular e de um mecanismo de precisão capaz de fazer com que o bloco a ser cortado avance em direção á navalha em micrômetros ou décimos de micrômetros. As navalhas podem ser descartáveis ou não.

Coloração: O material biológico, com raras exceções, é incolor, exigindo que seja tingido para que possa ser observado. Existem inúmeras técnicas para corar tecidos e células, cada uma com sua especificidade para os elementos que se quer destacar. A técnica mais utilizada combina dois corantes: a eosina e a hematoxilina. O primeiro é considerado um corante basófilo, pois tem afinidade com os componentes alcalinos das células e da matriz extracelular, corando-os num gradiente de rosa pálido a vermelho-forte, conforme o grau de afinidade. Já a hematoxilina é um corante acidófilo, pois se combina com os componentes ácidos especialmente ácidos nucléicos, tingindo-os de roxo-escuro ou preto, conforme a formula de preparação do corante. Os cortes que estão aderidos ás lâminas e ainda embebidos em parafina devem ser processados de maneira que a parafina seja removida, devem ser novamente hidratados para receber os corantes e, depois, desidratados mais uma vez para montagem definitiva da lâmina histológica.

Montagem: Após a coloração e a lavagem do excesso de corante, os cortes precisarão ser novamente desidratados e ser diafanizados para então receberem uma lamínula que será colada com uma resina. O preparo para a montagem segue o protocolo inverso ao do preparo para a coloração. Os cortes serão desidratados com etanol em uma serie de concentrações crescentes até 100%.O álcool será substituído pelo xilol, que tornará o corte translúcido e que ao mesmo tempo, é solvente da resina utilizada para colar a lamínula. Exemplos de Parasitoses encontrados através dessa técnica: Leishmaniose, Trypanosoma cruzi, etc.



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